研究人員發現肺癌中IL6的N-糖基化缺陷會誘導癌細胞轉移和對表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）產生耐藥性，揭示了其潛在機制，為肺癌治療提供了新的理論依據和潛在靶點。

研究背景：

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因之一，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）是攜帶敏感EGFR突變的肺腺癌患者的標準治療方法，但大多數患者會產生獲得性耐藥。IL6與受體結合后可激活多種信號通路，在肺癌進展和耐藥中起重要作用，但IL6的糖基化修飾對其功能的影響尚不清楚。

研究模式圖：

在非小細胞肺癌（NSCLC）細胞中，在未接受EGFR TKI治療的環境下，自分泌的IL6（NG-IL6）主要在N73位點發生N-糖基化修飾，在T170位點發生O-糖基化修飾。NG-IL6主要激活經典的JAK-STAT3軸，促進細胞增殖。然而，長期使用EGFR TKI治療會導致IL6分泌增加，同時抑制N-糖基轉移酶復合物成分（主要是STT3A或STT3B、RPN1/2、DAD1和 DDOST）的表達。這種抑制作用使得NG-IL6在N73位點的N-糖基化減少，進而導致NG-IL6在N73位點的N -糖基化進一步降低。結果是，獲得耐藥性后，NG-IL6的比例下降，而N-糖基化缺陷型IL6（deNG-IL6）的比例增加。反過來，deNG-IL6將信號偏好從JAK-STAT3軸轉移到SRC-YAP-SOX2軸。這種替代激活的SRC-YAP-SOX2信號促進細胞可塑性，并導致耐藥性的產生。

圖1.長期EGFR TKI治療誘導deNG-IL6驅動腫瘤耐藥。

研究方法:

細胞系與動物模型 ：使用多種肺癌細胞系和正常支氣管上皮細胞系，建立了Osimertinib耐藥細胞系和小鼠移植瘤模型。

樣本采集：收集肺癌患者的惡性胸腔積液（MPE）和配對的肺癌組織，包括未接受TKI治療和TKI耐藥患者的樣本。

實驗技術：采用Western blotting、ELISA、基因集富集分析（GSEA）、免疫沉淀、質譜分析、細胞遷移和侵襲實驗、動物體內轉移實驗等多種技術手段。

主要研究結果：

1. IL-6的N-糖基化修飾

圖2  肺癌細胞中IL-6的N-糖基化修飾

從肺癌患者惡性胸腔積液（MPE）中分離的肺腺癌細胞和多種肺癌細胞系分泌的 IL6 存在兩種形式（H-IL6和L-IL6，重鏈/輕鏈），且H/L比值于不同細胞系間存在差異。GSEA分析發現與N-糖基化過程相關的基因在癌癥組織中富集。抑制劑處理和酶切實驗等證實H-IL6的形成依賴于N-糖基化修飾。

2.  N-糖基化IL6促進酪氨酸磷酸化STAT3的核滯留而deNG-IL6誘導EMT的基因特征

圖3 N-糖基化IL6促進酪氨酸磷酸化STAT3的核滯留

研究者預測了兩個潛在的N-糖位點（N73和N172）和四個可能的O-糖位點（T166，T171，T170和S174）存在于hIL 6中。MS結果表明聚糖鏈位于N73、N172和T170，結合通過WB結果分析確定了IL6聚糖鏈的主要附著位點是N73 + T170，而非N172 + T170。

構建野生型和突變型IL6質粒轉染細胞，發現N73Q-IL6缺失H-IL6條帶，表明N73位點的糖基化對IL6功能有重要影響。構建野生型和突變型IL6質粒轉染細胞，發現N73Q-IL6缺失H-IL6條帶，表明N73位點的糖基化對IL6 功能有重要影響。與N73Q-IL6相比，NG-IL6可促進STAT3的酪氨酸磷酸化和核滯留，延長STAT3激活時間；而N73Q-IL6則誘導 STAT3激活時間縮短，并改變下游信號偏好，激活SRC-YAP-SOX2軸；此外，N73Q-IL6可誘導上皮-間質轉化（EMT）相關基因表達，促進肺癌細胞的遷移和侵襲能力，在體內可增強肺癌細胞的轉移能力，且這些作用可被針對SRC、YAP 和SOX2的抑制劑或shRNAs抑制；

圖4 deNG-IL6誘導非小細胞肺癌的EMT、遷移和轉移

此外，EGFR-TKI處理可誘導deNG-IL6的增加，IL6糖基化狀態的這種變化可以將GP130受體的下游信號傳導從JAK-STAT 3切換到SRC-YAP-SOX2。同時，具有高水平deNG-IL6的肺癌細胞傾向于具有EMT相關特性，可轉移到其他器官，并表現出對EGFR-TKI的抗性。

圖5 deNG-IL6將GP130信號偏好從JAK-STAT3切換到SRC-YAP軸

圖6 SOX2參與deNG-IL6誘導SRC-YAP軸驅動的腫瘤細胞遷移和轉移

3. Osimertinib誘導deNG-IL6的表達及SRC-YAP-OX2軸的激活

長期使用EGFR-TKI Osimertinib治療可誘導NG-IL6表達減少和deNG-IL6升高，從而導致肺癌細胞對EGFR-TKI產生耐藥性。

圖7 Osimertinib誘導deNG-IL6的表達和隨后SRC-YAP-OX2軸的激活

阻斷IL6的受體GP130和GP80后，各種細胞系中由WT-IL6和N73 Q-IL6所誘導的STAT 3活性降低，而SRC-YAP軸信號的激活增加，這些數據表明 OR細胞分泌的deNG-IL6不僅維持細胞存活，也有利于細胞遷移。

4. EGFR-TKI耐藥的NSCLC患者表現出高deNG-IL6表達和從JAK-STAT3到SRC-YAP的軸信號移位

為了證明deNG-IL6在NSCLC患者中的存在，研究從對EGFR TKIs具有na?ve（治療前）或耐藥（發生耐藥后）的患者的MPE中分離出MPECs， na?ve MPECs分泌H-IL6 多于 L-IL6，而在EGFR TKIs耐藥MPECs中則相反。同時，RNA測序的富集結果表明，N-糖基化過程在OSTu中增強 而在ORTu中減弱。

圖9 EGFR-TKI耐藥的NSCLC患者表現出高deNG-IL6表達和從JAK-STAT3到SRC-YAP的軸信號移位

EGFR-TKI 耐藥患者的MPECs中deNG-IL6比例增加，且腫瘤組織中STAT3信號減弱，SRC信號增強，進一步證明了deNG-IL6與耐藥和轉移的相關性臨床樣本分析顯示，EGFR-TKI 耐藥患者的MPECs中deNG-IL6比例增加，且腫瘤組織中STAT3信號減弱，SRC信號增強，進一步證明了deNG-IL6與耐藥和轉移的相關性。

研究結論：

1. 在NSCLC中，IL6主要在N73位點發生N-糖基化修飾，該修飾影響其下游信號通路的激活，N-糖基化缺陷的IL6可誘導EMT、遷移、轉移和耐藥。

2. EGFR-TKI治療可降低肺癌細胞中N-糖基化相關酶的表達，導致IL6的N-糖基化減少，進而激活SRC-YAP-SOX2軸，促進癌細胞的可塑性和耐藥性。

3. 監測IL6的糖基化狀態可能有助于預測肺癌的進展和EGFR-TKI耐藥性，為肺癌的治療提供新的潛在靶點和生物標志物。