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| 方法 | 周期 | 成本 | 適用場景 | 優勢/劣勢 |
|---|---|---|---|---|
| CRISPR-Cas9 | 2-4個月 | 低至中 | 簡單敲除、短片段插入 | 快、成本低，但可能脫靶 |
| ES細胞同源重組 | 6-12個月 | 高 | 復雜修飾（如條件性KO、大片段替換） | 精準，但周期長、需顯微操作 |
| Base Editing | 3-5個月 | 中至高 | 單堿基敲除（無DSB） | 避免雙鏈斷裂，但效率較低 |
靶點選擇：
針對目標基因的外顯子（優先選擇首ge編碼外顯子）。
使用在線工具（如Benchling或CRISPR Design）避免脫靶。
合成gRNA：化學合成或體外轉錄（需加5'端G增強轉錄效率）。
供體DNA：若需同時插入報告基因（如GFP），需設計同源臂（~800 bp）。
注射混合物：
Cas9 mRNA（50 ng/μL） + gRNA（25 ng/μL） ± 供體DNA（100 ng/μL）。
胚胎操作：
注射C57BL/6或BALB/c品系受精卵（原核期）。
移植至假孕母鼠子宮（約30個胚胎/母鼠）。
F0代篩查：
PCR + 測序：檢測Indel突變（引物設計在gRNA靶點外）。
T7E1或Surveyor assay：快速檢測切割效率。
傳代驗證：F0可能為嵌合體，需與野生型交配獲得F1雜合子。
完quanKO驗證：qPCR/Western blot確認基因表達缺失。
表型檢測：根據基因功能設計（如代謝、行為學、病理分析）。
同源臂：5'和3'臂各1.5-3 kb， flanking 目標外顯子。
篩選標記：NeoR（正選擇）和TK（負選擇，如HSV-TK）。
電轉遞送：將線性化載體轉入JM8或E14 ES細胞。
藥物篩選：G418（NeoR） + 更xi洛韋（TK陰性篩選）。
顯微注射：將陽性ES細胞注入C57BL/6囊胚。
嵌合體鑒定：毛色嵌合（如129 ES細胞→B6母鼠）。
嵌合體（公鼠）與野生型交配，篩選后代基因型。
設計floxed小鼠：
在目標外顯子兩側插入loxP位點（需同源重組或CRISPR-HDR）。
與Cre小鼠交配：
選擇組織特異性Cre品系（如Alb-Cre用于肝臟敲除）。
驗證敲除效率：
在目標組織中檢測基因缺失（避免全身性表型干擾）。
| 問題 | 原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| F0無突變 | gRNA效率低或Cas9活性不足 | 優化gRNA設計，提高注射濃度 |
| 嵌合體不傳代 | ES細胞貢獻不足 | 改用高貢獻率ES細胞系（如JM8A3.N1） |
| 非預期表型 | 脫靶效應或相鄰基因影響 | 多獨立品系驗證，全基因組測序排查 |
| 條件性KO不完quan | Cre表達效率低 | 換用強效Cre品系（如UBC-CreERT2） |
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