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KO first小鼠模型構建
一、KO-first 載體設計原理
KO-first載體通過精巧的基因陷阱（Gene Trap）和條件性模塊設計，實現"三位一體"功能：
野生型基因
KO-first等位基因
傳統KO
條件性KO
報告基因過表達
核心元件：
5'同源臂（1.5-3 kb）
SA-βgeo-pA（剪接受體-β半乳糖苷酶/新mei素抗性融合基因）
floxed 關鍵外顯子（通常第2-4號外顯子）
3'同源臂（1.5-3 kb）
FRT-flanked NeoR（用于陽性篩選，后續可切除）
二、KO first小鼠模型構建流程（以ES細胞同源重組為例）
1. 靶向載體構建
設計要點：
關鍵外顯子兩側插入loxP位點（間距通常1-2 kb）
在5'UTR插入SA-βgeo實現基因陷阱（組成型KO）
NeoR兩側加入FRT位點便于后續Flp刪除
改造
野生型基因: Exon1-Exon2-Exon3
KO-first等位基因: SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP-FRT-NeoR-FRT
2. ES細胞打靶
電轉與篩選：
線性化載體電轉至JM8A3.N1等ES細胞
G418（NeoR）陽性篩選7-10天
克隆驗證：
5'端PCR：F1（同源臂外側） + R1（βgeo內）
3'端PCR：F2（NeoR內） + R2（同源臂外側）
Southern blot確認單拷貝整合
3. 獲得嵌合體小鼠
囊胚注射：將陽性ES細胞注入C57BL/6N囊胚
嵌合體鑒定：毛色嵌合（129Sv ES細胞→B6背景）
4. 傳代與品系建立
第一步交配：嵌合體（公鼠）× WT（母鼠）
獲得F1代（SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP，NeoR+）
第二步交配：F1 × Flp deleter小鼠（刪除NeoR）
獲得"clean" KO-first小鼠（僅保留SA-βgeo和loxP）
三、三種應用模式切換
1. 傳統KO（組成型敲除）
機制：SA-βgeo阻斷基因轉錄，導致功能wan全喪失
驗證方法：
β-gal染色（報告基因表達）
Western blot檢測目標蛋白缺失
2. 條件性KO（組織特異性敲除）
交配策略：
× Cre
KO-first
cKO
關鍵點：
Cre介導的loxP重組刪除floxed外顯子
需驗證目標組織中的敲除效率（qPCR/免疫組化）
3. 報告基因過表達
利用SA-βgeo：
β-gal活性反映內源基因表達模式
可用于細胞譜系追蹤
4. 恢復野生型（可選）
與Flp deleter小鼠交配可刪除SA-βgeo，恢復野生型等位基因
四、技術優勢與局限性
優勢 | 挑戰 |
一個模型實現三種功能 | 載體構建復雜（需專業設計） |
避免多品系重復構建 | ES細胞打靶周期長（6-12個月） |
國際標準化（IKMC資源可獲取） | βgeo可能影響鄰近基因表達 |
五、關鍵優化策略
外顯子選擇：
優先選擇編碼關鍵功能域的外顯子
確保刪除后引起移碼突變（如外顯子2/3）
減少背景干擾：
使用自我刪除型NeoR（如neo-DTA）
選擇高重組效率ES細胞系（如JM8A3.N1）
表型分析對照：
必須包括：WT、KO-first純合子、KO-first × Cre
六、經典應用案例
Tsc1 KO-first模型：
傳統KO：胚胎致死（研究發育功能）
Nestin-Cre cKO：神經發育缺陷
β-gal報告基因：揭示Tsc1在腦區的表達模式
p53 KO-first模型：
傳統KO：自發腫瘤表型
K14-Cre cKO：研究皮膚特異性腫瘤發生
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