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目標基因（GOI, Gene of Interest）
將外源基因（如報告基因、突變基因或熒光蛋白）插入內源基因位點，或替換特定外顯子。
條件性調控系統
Cre-loxP系統：通過組織特異性Cre重組酶實現條件性激活。
FLEx（Flip-Excision）系統：結合Flp-FRT和Cre-loxP實現多重調控。
誘導型系統（如Tet-on/off、他莫xi芬誘導的Cre-ERT2）。
啟動子：αMHC（Myh6）、cT*T（Tnnt2）驅動Cre表達。
報告基因：如tdTomato（loxP-stop-loxP-tdTomato）用于追蹤表達。
靶位點選擇
安全港位點（如Rosa26、H11）或內源基因位點（需同源重組）。
避免干擾鄰近基因（需UCSC基因組瀏覽器分析）。
條件性敲入結構（以Rosa26-loxP-STOP-loxP-GOI為例）：
5'同源臂 + loxP-STOP-loxP + GOI + 3'同源臂 + 篩選標記（如Neo）。
CRISPR-Cas9介導的KI
設計sgRNA靶向插入位點，與供體載體共注射至受精卵。
供體載體：包含同源臂和條件性表達盒（如圖1）。
ES細胞打靶（傳統方法）
電轉ES細胞后篩選陽性克隆，顯微注射至囊胚。
Founder小鼠鑒定
PCR或Southern blot驗證正確整合。
與Cre品系交配
例如：Rosa26-lsl-GOI × αMHC-Cre → 心臟特異性GOI表達。
PCR：檢測loxP位點、GOI插入及Cre重組效率。
測序：確認無脫靶突變。
qRT-PCR/Western blot：檢測GOI在心臟中的表達水平。
免疫熒光/組織染色：定位GOI表達（如tdTomato熒光）。
心臟功能：超聲心動圖（EF%、FS%）、心電圖（心律失常）。
病理分析：心肌纖維化（Masson）、 hypertrophy（WGA染色）。
解決：優化Cre品系（如高表達αMHC-Cre）或使用誘導型Cre（他mo昔芬）。
優化：加強STOP序列（如三重polyA信號）或選擇更嚴格的啟動子。
解決：全基因組測序（WGS）篩選Founder小鼠。
構建：Rosa26-lsl-tdTomato × αMHC-Cre → 心肌細胞紅色熒光標記。
用途：追蹤心肌細胞譜系或移植細胞命運。
構建：Knock-in loxP-STOP-loxP-mutant-Kras × cT*T-Cre → 心肌特異性致癌突變模型。
對照設計：
必須包括：無Cre的GOI小鼠（loxP-STOP-loxP-GOI）、Cre單獨表達小鼠。
時間控制：
誘導型Cre（如Cre-ERT2）需優化他mi昔芬劑量和時間窗口。
倫理與標準化：
遵循ARRIVE指南，確保動物福利和實驗可重復性。
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