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1取材及冷凍
切取組織時應使用鋒利的刀、剪，切取組織塊時，從刀的根部開始向后拉動切開組織。組織塊的厚度約為0.2~0.3cm，大小為1.5cm×1.5cm x 0.3cm為宜。將要切取的平面朝下放到塑料包埋盒底部，在液氮表面停留約30秒把組織凍硬，注意停留太久易使組織凍裂。立即把凍硬的組織塊裝入自封袋中保存于-80℃低溫冰箱。
2切片
切片前將組織樣本置于-20℃冰箱內復溫30 min，切片厚度為5～7 μm，太厚貼片不牢固，更不利于鏡下觀察。包埋可用OCT,也可用膠水代替。用高粘度膠水在支撐架上滴加形成一個小臺，將組織放上，在組織周圍用膠水包埋一下放在冷臺上冷凍。包埋使組織上、下方有一定的邊，有利于連續切片，而且展片時可以避免組織皺縮。待組織達適當硬度即可切片，切片時組織的冷凍程度是切片的最關鍵環節，凍得過硬，切片呈碎屑狀；凍得不夠，切片呈粥糜狀或切不成片。
3貼片和固定
載玻片必須預先處理，常用多聚賴氨酸包被。需要注意多聚賴氨酸不可反復使用，且不能用玻璃容器存放。將切片小心貼附于載玻片上，貼片時手要穩，并且手要有一個向下伸展的動作，立即將切片放入固定液中。以往的經驗用吹風機吹干再固定，但完全干后的組織容易在沖洗時脫片，并且組織細胞發生退行性變；另外，可溶性抗原不能晾干，應立即固定。固定液的選擇因抗原而異，但一般抗原可用4℃預冷的丙酮固定15 min，此固定劑比較溫和，對抗原保存較好。
4 油紅O染色步驟
（1）切片用4%甲醛固定10分鐘；
（2）蒸餾水洗；
（3）60％異丙醇浸洗；
（4）油紅O染液10分鐘(染液可回收再利用)；
（5）60％異丙醇分色至背景無色；
（6）蒸餾水洗；
（7）Mayer蘇木精復染；
（8）自來水洗(藍化)1～3分鐘；
（9）蒸餾水洗；
（10）甘油明膠封片。
5 圖像采集
通過顯微鏡拍照，采集分析樣本相關部位。
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