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藥物誘導基因敲除實驗

簡要描述:藥物誘導基因敲除實驗(如他mo昔芬系統或四環素系統)是在靶基因兩側插入特定重組酶識別位點后,通過給藥定時激活Cre-ER或Tet-On/Tet-Off等重組酶,實現特定器官、特定時間點的高效基因刪除,兼顧全身敲除的che底性與條件性敲除的時空精度,是研究基因功能和藥物靶點驗證的利器。

  • 更新時間:2025-07-24 16:07:50
  • 訪  問  量:225

詳細介紹

一、藥物誘導基因敲除實驗核心系統及原理

  1. 他mo昔芬(Tamoxifen)誘導系統

    • 時間可控性強,避免胚胎期致死問題;

    • 高靈敏度版本(如Cre-ERT2)對4-OHT的敏感性提升10倍。

    • 原理:將Cre重組酶與突變型雌激素受體(ER-LBD)融合形成Cre-ER(Tam)融合蛋白。未給藥時,該蛋白與熱休克蛋白(HSP90)結合并滯留于細胞質;給藥后,他mo昔芬與ER結合,釋放Cre進入細胞核,介導loxP位點間的重組。

    • 優勢

  2. 四環素誘導系統(Tet-On/Tet-Off)

    • Tet-Off系統:無需四環素時,tTA蛋白激活Cre表達;給予多xi環素(Dox)則抑制Cre活性,適用于持續敲除場景。

    • Tet-On系統:需Dox激活rtTA蛋白才能啟動Cre表達,適用于短期誘導。

    • 應用:常用于發育階段特異性基因功能研究,如肺上皮細胞基因敲除。

  3. 干擾素誘導系統(Mx1-Cre)

    • 通過注射polyI:C或干擾素誘導Cre表達,適用于免疫細胞或肝臟等干擾素響應組織的研究。


二、藥物誘導基因敲除實驗設計流程

  1. 構建Flox小鼠:在目標基因兩側插入loxP序列,確保基因正常功能不受影響。

  2. 選擇Cre工具鼠:根據實驗需求選擇組織特異性或藥物誘導型Cre品系(如Alb-CreERT2用于肝臟特異性敲除)。

  3. 藥物處理

    • 他mo昔芬:成年小鼠連續5天腹腔注射(75-100 mg/kg),溶解于玉米油或葵花籽油。

    • 多xi環素:通過含藥飼料(600 mg/kg)連續喂養14天。

  4. 表型分析與驗證:通過PCR、Western blot或熒光報告系統確認敲除效率。


三、應用場景

  1. 疾病模型構建:如腫瘤研究中誘導性敲除致癌基因,觀察腫瘤發生動態。

  2. 發育生物學:研究特定發育階段(如胚胎期或成年期)基因功能。

  3. 組織特異性研究:結合組織特異性啟動子(如神經元Nestin啟動子),解析基因在特定細胞類型中的作用。


四、注意事項

  1. 藥物交叉污染:處理組與對照組需分籠飼養,避免他mo昔芬通過糞便交叉誘導。

  2. 脫靶效應:部分Cre品系存在本底活性(如Cre-ERT2的泄露表達),需設置嚴格對照。

  3. 劑量優化:藥物濃度和給藥頻率需根據動物年齡、品系調整,避免毒性。


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